مطالعه:
جامعه مورد بررسي کليه سويه‌هاي P. aeruginosa به دست آمده از بيماران بستري در بيمارستان‌هاي شهيد صدوقي و شهيد رهنمون و بيمارستان سوانح سوختگي استان يزد مي‌باشد که از اسفند 91 تا اسفند 92 جمع آوري شده اند.
2-5- روش کار
2-5-1- انواع محيط کشت
تمامي محيط‌هاي کشت بصورت آماده و به شکل پودر موجود بودند. ابتدا طبق دستور العمل کارخانه سازنده آن ونوشته بر روي جعبه ، مقدار معيني از پودر را وزن کرده و با مقدار معيني آّب مقطر مخلوط کرده وتوسط حرارت خوب حل شد. سپس محيط کشت به مدت 15 دقيقه در دماي 121 درجه سانتي گراد و فشار 15 پاند بر اينچ مربع اتوکلاو شد و درون پليت استريل در مجاور شعله پخش شد. محيط‌هايي که بايد در لوله باشند ابتدا در لوله ريخته سپس اتوکلاو شدند. جهت کشت از محيط EMB، مک کانکي و جهت تعيين هويت باکتري ازمحيط‌هاي Triple Suger Iron Agar ، SIM(براي حرکت ، اندول ، SH2)، MR-VP، Oxidative Fermentative و سيمون سيترات استفاده شد. بعد از کشت و نگهداري به مدت 18-24 ساعت در حرارت 37 درجه سانتي گراد با مشاهده تغيير رنگ محيط ، نتيجه مثبت يا منفي مشخص گرديد.
2-5-2- مکانکي آگار(Mac Conkey agar)
اين محيط براي كشت باسيل هاي گرم منفي مفيداست و محتوي نمك صفراوي است تا باكتري‌هاي غير روده اي را مهار كند و نيز براي تشخيص كلي فرم‌هاي تخمير كننده لاكتوز از سالمونلاهاي غير تخمير كننده لاكتوز و گروه‌هاي ديسانتري، حاوي لاكتوز با قرمز خنثي (Nautral red) است. مي‌توان غلظت توروكولات سديم را كاهش داد . تا براي ارگانيسم‌هايي كه تحمل كمتري دارند مناسب باشد. حذف كلريدسديم از محيط، از گسترش كلوني‌هاي پروتئوس جلوگيري مي‌كند . باكتري‌هاي تخمير كننده ي لاكتو )لاكتوز مثبت‌ها( كلني‌هايي به رنگ ارغواني و باكتري‌هايي كه قادر به تخمير نيستند)لاكتوز منفي‌ها) كلني‌هايي بي رنگ ايجاد مي‌نمايند . رنگ ارغواني كلني‌هاي باكتري‌هاي لاكتوز مثبت مربوط به واكنش اسيدي است كه در نتيجه تخمير قند لاكتوز در مجاورت املاح صفراوي و جذب نوترال رد حاصل شده است. معرف نوترال رد در محيط قليايي بي رنگ و در محيط اسيدي قرمز رنگ است اين محيط کشت براي ايزولاسيون کلني هاي P.aeruginosa مورد استفاده قرار گرفت [67].
2-5-3- محيط کشت 37SIM
در اين محيط کشت سه آزمايش توليد SH2 ، توليد ايندول از تريپتوفان و حركت باكتري بررسي گرديد. ايندول مثبت با ريختن 5 قطره معرف کواکس بر روي كشت 24 ساعته در اين محيط و ايجاد رنگ ارغواني نتيجه گيري شد . در مورد باكتري ايندول منفي ، بعد از ريختن معرف تغيير رنگي حاصل نشد .آخرين مولفه يعني حركت مثبت نيز با ايجاد كدورت يكنواخت در محيط كشت مشخص شد . سودوموناس‌ها متحركند و رشد باكتري بصورت حلقه‌اي در اطراف لوله مشاهده گرديد.
ايجاد سولفيد هيدرژن توسط باکتري به صورت سياه شدن ظاهر مي‌گردد و در صورت متحرک بودن باکتري کشت شده، سياهي نيز تمام محيطي که باکتري پخش گرديده است، انتشار مي‌يابد. سياه شدن محصول واکنش هيدروژن سولفوره توليد شده با سولفات آهن و تشکيل رسوب سولفوره آهن سياه رنگ مي‌باشد. با اضافه کردن يک ميلي ليتر معرف کواکس(Kovac`s) به کشت 24 ساعته، ظهور رنگ ارغواني در سطح کشت دليل بر توليد اندول توسط باکتري است. باکتري‌هاي که حاوي مجموعه آنزيم‌هايي که اصطلاحا تريپتوفاناز ناميده مي‌گردند، باشند، قادرند طي يک سري واکنش‌هاي شيميايي تريپتوفان را اکسيده و اندول استيک توليد نمايند [68].
2-5-4- روش آماده سازي معرف کواکس جهت تست اندول
فسفو دي متيل آمينو بنزآلدئيد —————— 5 گرم
ايزو آميل الکل —————— 75 ميلي ليتر
اسيد کلريدريک ——————- 25 ميلي ليتر
آلدئيد را در الکل به آرامي حل واز بن ماري 55-50 درجه سانتيگراد استفاده گرديد و به آن اسيد اضافه و دور از نور و در 4 درجه سانتيگراد نگهداري شد . رنگ معرف بايد از زرد روشن تا قهوهاي روشن باشد [3].
2-5-5- محيط کشت 38OF
با کشت باکتري در اين محيط مي‌توان مشخص نمود که استفاده باکتري از کربوهيدرات از طريق اکسيداسيون يا از طريق تخمير صورت گرفته است. از اين محيط دو عدد، يکي حاوي پارافين و ديگري فاقد پارافين تهيه کرده و نمونه در هر دو محيط کشت داده شد. باکتري P. aeruginosa تنها از طريق اکسيداسيون از قند گلوکز استفاده کرد، در لوله فاقد پارافين، محيط اسيدي شده، که در مجاورت معرف بروموتيمول بلو به رنگ زرد در آمد. رنگ زرد از بالاي لوله شروع شد. اگر باکتري از طريق فرمنتاتيو قندها را تخمير نمايد، در هر دو لوله کشت (حاوي پارافين و فاقد پارافين) بر اثر توليد اسيد رنگ زرد ديده شد [3].
2-5-6- محيط کشت TSI39
محيط TSI حاوي معرف فنل ـ رد ، سولفات فرو ، تيو سولفات سديم ( براي تشخيص توليد گاز سولفيد هيدروژن ) و سه قند گلوگز ، لاكتوز و سوكروز است كه غلظت گلوكز درمحيط 1/0 غلظت دو قند ديگر مي‌باشد . اين محيط قبل از كشت به دليل داشتن معرف فنل ـ رد قرمز رنگ است . با استفاده از TSI سه خصوصيت در يك باكتري مشخص گرديد. الف : توانايي توليد گاز CO2 , H2 از متابوليسم قندها . ب : توانايي توليد مقادير زيادي گاز سولفيد هيدروژن كه از طريق سياه شدن محيط. باکتري در اين محيط با استفاده از تيو سولفات سديم H2S توليد کرد که با املاح آهن موجود در محيط رسوب سياه رنگ ايجاد کرد.
ج : توانايي تخمير گلوكز ، لاكتوز و سوكروز . در صورت تخمير قند با توليد CO2 ، حباب و ترک خوردن و حتي جابجايي محيط مشاهده مي‌گردد. با تخمير قند تمام لوله اسيدي شد و محيط کشت به رنگ زرد در مي‌آيد و درغير اين صورت تمام لوله قليايي مي‌شود و تغيير رنگي صورت نمي گيرد. باکتري P. aeruginosa قادر به تخميرقند نبوده و محيط کشت به رنگ قرمز باقي ماند [3].
2-5-7- محيط سيمون سيترات40
حاوي نمك‌ها، كاتيون‌ها، بافرهاي سيترات و بروم تيمول آبي به عنوان انديكاتور است، مي‌تواند در pH قليايي ( بالاتر از 6/7 ) و در جريان توليد تركيبات قليايي (تركيبات آمونيوم ) حاصل از مصرف سيترات توليد رنگ آبي درمحيط نمايد. باکتري به صورت سطحي کشت داده شد. بعد از 24 ساعت باكتري از منبع كربن استفاده کرد ، رنگ محيط آبي شد ودر غير اين صورت رنگ محيط تغييري نكرده و رشدي نيز مشاهده نگرديد [3].
2-5-8- محيط مايع41( ( MR-VP
يک کلني از باکتري تلقيح شد و به مدت حداقل 48 ساعت در 37 درجه سانتي گراد گذاشته شد. مقدار 5/2 ميلي ليتر از اين مايع به لوله ديگر جهت آزمايش VP منتقل گرديد.
آزمايش VP: به لوله کشت داده شده و انکوبه شده حدود6 /0 ميلي ليتر معرف آلفا نفتول معرف (A) و مقدار 2/0 ميلي ليتر محلول پتاس معرف(B) اضافه گرديد و خوب تکان داده اگر تغيير رنگ صورت نگرفت آنرا به مدت سي دقيقه به حال خود گذاشته و در صورتي که ظهور رنگ صورتي تا قرمز پديدار شود، آزمايش VP مثبت و اگر تغيير رنگي صورت نپذيرد و در صورت عدم تغيير رنگ منفي گزارش شد.
2-5-9- طرز تهيه معرف VP
معرف A :
1-آلفانفتول ————- 5 گرم
2-الکل اتليک مطلق——- 100 ميلي ليتر
معرف B :
1-هيدروکسيد پتاسيم —– 40 گرم
2-آب مقطر ———— 100 ميلي ليتر
آزمايش MR: مقدار 6/0 ميلي ليتر معرف رنگي متيل رد اضافه گرديد و با ظهور رنگ قرمز آزمايش MR مثبت گرديد. در صورت پيدايش رنگ نارنجي آزمايش MR مثبت ضعيف و در صورت عدم تغيير و پايداري رنگ زرد آزمايش MR منفي گزارش شد.
2-5-10- طرز تهيه معرف MR
1-متيل رد ——– 04/0 گرم
2-اتانول ——– 40 ميلي ليتر
3-|آب مقطر ——– 100 ميلي ليتر
متيل رد را در اتانول حل گرديد و به حجم 100 ميلي ليتر رسانده شد [3].
2-5-11- تست اکسيداز42
اگر باکتري داراي آنزيم اکسيداز باشد ، تترا متيل پي فنيلين دي آمين دي هيدروکلرايد را به ايندو فنل مي‌نمايد که به رنگ بنفش ديده مي‌شود.
محلول 1% تترامتيل – پارافنيلن دي آمين – دي هيدروكلرايد مورد استفاده قرار گرفت. معمولاً مي‌توان جهت مصرف روزانه 50 ميلي گرم پودر را در ظروف در‌دار كوچك پلاستيكي ريخته و 5 ميلي ليتر آب مقطر به آن اضافه نمود و هر روز يك ويال را مورد استفاده قرار داد.
يك كاغذ صافي تميز در سطح يك پليت استريل پلاستيكي قرار گرفت و با چند قطره از معرف تازه مرطوب گشت.
مقدار كمي از كلني جوان (كمتر از 24 ساعت) را با استفاده از يك اپليكاتور چوبي يا لوپ پلاتينيوم (از لوپ آهني استفاده نمي کنيم) تميز برداشته و بر روي كاغذ صافي مرطوب شده قرار گرفت.
4.تغيير رنگ كلني‌ها به رنگ آبي و بنفش (در مدت 10 ثانيه) مورد بررسي قرارگرفت، زمان بررسي رنگ اهميت زيادي دارد.
ارگانيسم‌هائي كه داراي آنزيم اكسيداز هستند (گونه‌هاي جنس پسودوموناس ) رنگ كلني را در مدت 10 ثانيه به رنگ بنفش تغيير مي‌دهند. ارگانيسم‌هائي كه فاقد اين آنزيم هستند (مانند اشريشيا كولي) در مدت 10 ثانيه هيچ تغيير رنگي را ايجاد نمي‌نمايند.
2-6- روش اجراي کار

دیدگاهتان را بنویسید