بيوتيک‌هاي بتالاکتام بخصوص سفالوسپورين‌ها استفاده مي شود که در سال‌هاي اخير مقاومت کلبسيلا نسبت به بتالاکتام‌ها افزايش چشمگيري داشته است [57].
امروزه با بروز مقاومتهاي دارويي در ميان باکتريهاي بيماريزا، درمان اين دسته از بيماريهاي عفوني با مشکلات فراواني مواجه شده است . از ديرباز آنتي بيوتيکهاي بتالاکتام از مرسومترين درمان عفونتهاي باکتريايي محسوب مي شدند .باکتريها با توليد آنزيمهاي بتالاکتاماز توانسته اند به اين کلاس از آنتي بيوتيکها مقاومت يابند [58].
مكانيسم اصلي مقاومت باكتري‌ها در برابر آنتي بيوتيك‌هاي بتالاكتام توليد بتالاكتاماز مي باشد؛ اين آنزيم‌ها آنتي بيوتيک‌هاي بتالاکتام را قبل از اينکه به پروتئين‌هاي متصل شونده به پني سيلين ( PBP ) اتصال يابند، هيدروليز و غير فعال مي کنند، بتالاكتامازها به دو صورت مولكولي(Ambler) و عملكردي(bush-jacoby-medeiros) طبقه بندي مي‌شوند [60، 59].
پني سيليناز اولين آنزيم بتالاكتامازي است كه شناسايي شد . اين بتا-لاكتاماز غيرفعال كننده پني سيلين‌ها مي باشد. اين آنزيم اولين بار در سال 1940 از اشرشياكلي جداسازي گرديد[62، 61].
بتالاكتامازهاي با طيف گسترش يافته نيز به دنبال مصرف فراوان آنتي بيوتيك‌هاي گسترده طيف ، در اوايل دهه 1980 در اروپا شناسايي شدند و اولين بتا لاكتامازهاي وسيع الطيف در سال 1983 در آلمان شناسايي گرديدند [63].
بتالاكتامازهاي با طيف گسترش يافته در برخي از اعضاء خانواده enterobacteriaceae و P.aeruginosa يافت مي شود . عمده ترين باكتري‌هاي مولد بتا لاكتامازهاي با طيف گسترش يافته عبارتند از: ٍE.coli، K.pneumoniae و ساير گونه‌هاي كلبسيلا [66، 65، 64].
طبقه بندي بتالاكتامازها به لحاظ عملكردي هنگامي شروع شد كه سفالوسپورينازها از پني سيلينازها متمايز شدند و به چهار گروه عملكردي تقسيم مي شوند [68، 67].
گروه اول : سفالوسپورينازهايي كه به خوبي توسط كلاولانيك اسيد مهار نمي شوند. گروه دوم: شامل پني سيليناز و سفالوسپوريناز يا هر دو كه به طور كلي توسط مهاركننده‌هاي بتالاكتاماز مهار مي‌شوند. گروه سوم: متالوبتالاكتاماز بوده و از يون‌هاي روي براي تخريب حلقه بتالاكتام استفاده مي كنند . اين آنزيم‌ها قادر به هيدروليز پني سيلين‌ها، سفالوسپورين‌ها و كارباپنم‌ها هستند. گروه چهارم پني سيليناز بوده و توسط كلاولانيك اسيد مهار نمي شوند.
جديدترين مطالعات بتالاكتامازها را به چهار گروه تقسيم مي‌كند1)بتالاكتامازهاي وسيع الطيف، 2) مشتقات بتالاكتامازهاي كلاس A مقاوم به مهار كننده‌ها، 3 (بتالاكتامازهاي AmpC مرتبط با پلاسميد، 4) بتالاكتامازهاي هيدروليزكننده كارباپنم‌ها.
بتالاكتامازهاي وسيع الطيف Extended spectrum lactamases(ESBLs) دسته اي از آنزيم‌هاي بتالاكتاماز مي باشند كه اهميت ويژه اي در درمان ضد ميكروبي دارند. اين آنزيم‌ها قادر به هيدروليز كامل اكسي مينو بتالاكتام‌ها كه در ساختمان نسل سوم سفالوسپورين‌ها هستند . اين آنزيم‌ها ابتدا در دهه 1980تشخيص داده شدند كه بيشتر از نوع SHV, TEM بودند و در نتيجه ي جهش‌هاي نقطه اي از آنزيم‌هاي اصلي فاقد فعاليت وسيع الطيف ايجاد شده اند، خانوادهCTX-M از ESBL‌ها در سال 1989 براي اولين بار از آلمان گزارش شد و پس از آن در نقاط مختلف دنيا گسترش يافت. اين آنزيم غالباً در E.coli و Klebsiella گزارش شده اما در ساير enterobacteriaceae نيز ديده شده است [69].
متأسفانه مصرف بي رويه ي آنتي بيوتيك‌ها در دهه‌هاي اخير باعث افزايش ظهور سويه‌هاي مقاوم با مقاومت چند گانه در كلبسيلا پنومونيه توليد کننده آنزيم بتالاكتاماز با طيف وسيع (ESBLs)شده است. ژن‌هاي كدكننده ESBLs معمولاً به روي پلاسميد يافت مي‌شوند و توانايي انتقال به سويه‌هاي گرم منفي ديگر را دارند. در دو دهه اخير، انواع زيادي از ESBLs شناسايي شده اند، تاكنون 400 تيپ گوناگون بتا لاكتامازها از نمونه‌هاي كلينيكي جداشده است [70].
آنزيم‌هاي بتالاکتاماز در باکتريها بسيار متنوعند و در پاسخ به فشار انتخابي آنتي بيوتيک، دائماً در حال موتاسيون و يا جايگزيني اسيدهاي آمينه به ويژه در جايگاه فعال آنزيم هستند به طوريکه باعث ظهور انواع جديدي از بتا لاکتامازهاي با طيف گسترش يافته (ESBL) شده است [71].
بيش از 150 نوع ESBL از کشورهاي مختلف گزارش شده است که غالباً باکتريهاي انتروباکترياسه مولد آن هستند [72].
بتالاکتامازهاي با طيف وسيع آنزيمهايي هستند که علاوه بر ايجاد مقاومت به پنيسيلينها، واسطه ايجاد مقاومت به طيف وسيعي از سفالوسپورينهاي نسل سوم مثل سفتازيديم، سفوتاکسيم، سفترياکسون و مونوباکتامها مثل آزترئونام محسوب ميشوند .بر خلاف موارد بالا معمولاً مقاومت نسبت به سفامايسينها مثل سفوکسيتين و سفوتتان و نيز کارباپنمها مثل ايميپنم و مرپنم در اين دسته باکتريها مشاهده نميشود. عوامل بازدارنده بتالاکتامازها مانند کلاولانيک اسيد، سولباکتام و تازوباکتام اثر بازدارندگي بر عملکرد اين آنزيمها دارند [73].
E.coli، K.pneumoniae ، K.oxytoca، Proteus mirabilis ، Enterobacter cloacae ، Morganella morganii ، Serratia marcescens ، Burkholderia cepacia ، Capnocytophaga ochracea ، Acinetobacter ، گونه‌هاي Citrobacter و Salmonella از جمله باکتري‌هايي‌هايي هستند که توليد اين نوع از بتا لاکتامازها در آنها مشاهده شده است [75، 74].
درمان عفونتهاي حاصل از باکتريهاي مولد اين آنزيمها بغرنج است چون از يک سو مقاومت به طيف وسيعي از سفالوسپورينها مشاهده ميشود و از سوي ديگر بسياري از ژنهاي ESBL به روي پلاسيمدهاي بزرگي) بيش از 100 کيلوباز) قرار دارد که همزمان حامل ژنهاي مقاومت به ساير عوامل ضدميکروبي مثل آمينوگليکوزيدها، کلرامفنيکل، سولفوناميدها و تتراسايکلين نيز است . اين عفونتها داراي رابطه معني داري با ميزان مرگ و مير بيماران است و بار مالي زيادي را در پي دارد [76].
اين پلاسميدهاي کونژوگاتيو به راحتي ميتوانند از يک سويه به سويه ي ديگر و يا حتي به گونه‌هاي ديگري منتقل شوند [77].
از آنجائيكه وجود مقاومت وابسته به ESBLs در مناطق مختلف جهان متفاوت بوده و سويه‌هاي داراي ESBLs در شرايط vivo in علاوه بر آنتي بيوتيكهاي بتالاكتام به گروههاي ديگر آنتي بيوتيكي نيز مقاومت نشان مي‌دهند بر آن شديم تا شيوع ESBLs را در سويه‌هاي کلبسيلا در بخش‌هاي مختلف در بيمارستان‌هاي شهر يزد مورد بررسي قرار داده تا با استفاده از نتايج بدست آمده و در صورت وجود شيوع زياد جهت تعيين روتين ESBLs روش DDST را در نمونه‌هاي باليني رايج نمائيم.
2-2- اهداف
2-2-1- اهداف اصلي طرح
فراواني آنزيم بتالاکتاماز با طيف گستردش يافته ( ESBLs) در کلبسيلا پنومونيه جدا شده از بيماران بستري در بيمارستان‌هاي شهر يزد بروش Double Disk Synergy Test
2-2-2- اهداف ويژه طرح
1. فراواني نسبي آنزيم ESBLs در سويه‌هاي کلبسيلا پنومونيه.
2. فراواني نسبي آنزيم ESBLs در سويه‌هاي کلبسيلا پنومونيه بر حسب نوع نمونه.
3. فراواني نسبي آنزيم ESBLs در سويه‌هاي کلبسيلا پنومونيه بر حسب بخش.
4. فراواني نسبي آنزيم ESBLs در سويه‌هاي کلبسيلا پنومونيه بر حسب سن.
5. فراواني نسبي آنزيم ESBLs در سويه‌هاي کلبسيلا پنومونيه بر حسب جنس.
6. فراواني نسبي مقاومت سويه‌هاي کلبسيلا پنومونيه به آنتي بيوتيک‌هاي مختلف به روش ديسک ديفيوژن.
7. فراواني نسبي آنزيم ESBLs در سويه‌هاي کلبسيلا پنومونيه بر حسب وضعيت مقاومت به آنتي بيوتيک هاي مختلف.
2-3- سؤالات و فرضيات
1. فراواني نسبي آنزيم ESBLs در سويه‌هاي کلبسيلا پنومونيه متفاوت است.
2. فراواني نسبي آنزيم ESBLs در سويه‌هاي کلبسيلا پنومونيه بر حسب نوع نمونه متفاوت است.
3. فراواني نسبي آنزيم ESBLs در سويه‌هاي کلبسيلا پنومونيه بر حسب بخش متفاوت است.
4. فراواني نسبي آنزيم ESBLs در سويه‌هاي کلبسيلا پنومونيه بر حسب سن متفاوت است.
5. فراواني نسبي آنزيم ESBLs در سويه‌هاي کلبسيلا پنومونيه بر حسب جنس متفاوت است.
6. فراواني نسبي مقاومت سويه‌هاي کلبسيلا پنمونيه در آنتي بيوتيک‌هاي مختلف متفاوت است.
7. فراواني نسبي آنزيم ESBLs در سويه‌هاي کلبسيلا پنومونيه بر حسب وضعيت مقاومت به آنتي بيوتيک هاي مختلف متفاوت است.

2-4- نوع و روش مطالعه
مطالعه از نوع توصيفي – تحليلي بود که به روش مقطعي مي باشد که با استفاده از روش سرشماري، تمام نمونه‌ها مشتمل بر K.pneumoniae جمع آوري شده از بيمارستان‌هاي شهيد صدوقي و شهيد رهنمون و سوانح سوختگي استان يزد مورد ارزيابي قرار گرفتند.
جامعه مورد بررسي و خصوصيات افراد مورد مطالعه:
جامعه مورد بررسي کليه سويه‌هاي K.pneumoniae به دست آمده از بيماران بستري در بيمارستان‌هاي شهيد صدوقي و شهيد رهنمون و سوانح سوختگي استان يزد مي باشد که بين اسفند 91 تا اسفند 92 جمع آوري شده اند.
2-5- روش کار
2-5-1- محيط مورد استفاده جهت کشت باکتري
ائوزين متيلن بلو EMB(Eosin methylene-blue agar):
اين محيط کشت محيط افتراقي- انتخابي مفيدي در جداسازي و شناسايي باکتري‌هاي روده اي گرم منفي است. رنگ‌هاي ائوزين y و متيلن بلو، اجزاء انتخابي هستند که افزوده شده اند تا در حالي که به باکتري‌هاي گرم منفي اجازه رشد مي دهند از رشد باکتري‌هاي گرم مثبت جلوگيري کنند. کربوهيدرات‌هاي لاکتوز و سوکروز براي اين که ايزوله‌ها را بر اساس تخمير لاکتوز و ساکاروز تفکيک کنند، اضافه شده اند. تخمير با تغيير رنگ و رسوب رنگ‌هاي افزوده شده، در اثر افت PH، مشخص و ارزيابي مي شود.
E.Coli يک کلي فرم تخمير کننده لاکتوز است که به طور شاخص و تيپيک، کلوني‌هاي آبي-سياه با درخشندگي فلزي متمايل به سبز ايجاد مي کند. ديگر کلي فرم‌هاي تخمير کننده مثل Enterobacter و Klebsiella ، کلوني‌هاي صورتي تشکيل مي دهند. کلوني‌هاي غير تخمير کننده شفاف، کهربايي رنگ يا بي رنگ هستند[78].
2-5-2- محيط کشت‌هاي مورد استفاده جهت تعيين هويت باکتري
سيمون سيترات آگار(Simmons Citrate agar):
براي تعيين قدرت باکتري در استفاده از سيترات به عنوان تنها عامل کربن دار موجود در محيط مي باشد. باکتري‌هاي که قادر به رشد در اين محيط باشند؛ در حقيقت توانسته اند از سيترات که تنها عامل کربن دار در محيط است؛ استفاده کنند. در نتيجه در مجاورت معرف رنگي بروموتيمول بلو به رنگ آبي در مي آيند. در غير اين صورت به علت عدم رشد باکتري و عدم تغيير رنگ محيط آزمايش سيترات منفي است.
باکتري‌هاي که قادراند سيترات را به عنوان تنها منبع کربن و منبع انرژي و نمک آمونيوم را به عنوان تنها منبع ازت جهت رشد خود به کار برند قادرهستند محيط سيمون سيترات که حاوي معرف بروموتيمول آبي(سبز رنگ) است؛ را به رنگ آبي تبديل کنند.
روش کار
باکتري را در محيط سيمون سيترات که به صورت سطح شيب دار است کشت داده و در دماي 37 درجه سانتي گراد به مدت 24 ساعت نگهداري شد. در صورتي که رنگ سبز اوليه به رنگ آبي تبديل شود؛ واکنش مثبت است(مثل Klebsiella) رنگ سبز نشان منفي بودن واکنش است [78].
محيط کشت متيل رد-وژوسپروسکار MR-VP(Methylred-Vegesproskaure broth):
اين محيط ملاک آزمايشي مي باشد براي تفکيک مسيرهاي تخمير گلوکز و نهايتا ايجاد ترکيبات اسيدهاي الي مختلف و يا توليد بوتانديول يا بوتيلن گليکول بوده که از اين آزمايش در تفکيک و تشخيص کلي فرم‌ها از هم مورد استفاده قرارمي گيرد.
آزمايش MR: پس از انجام کشت و انکوباسيون در دماي

دیدگاهتان را بنویسید